Методы

Лабораторная часть

Из тотальной ДНК с помощью набора KAPA HyperPlus (Roche, Швейцария) согласно инструкции производителя была подготовлена фрагментная библиотека. Специалисты фрагментировали ДНК с помощью фрагментазы в дипазоне длин 150-220 п.н. После амплификации концентрация библиотек измерялась с помощью Qubit (ThermoFisher Scientific, США) согласно инструкции производителя. Размер готовых библиотек и возможное наличие димеров праймеров/адаптеров были определены с помощью Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, США), оптимальная длина фрагментов с адаптерами составляла 290-330 п.н. Далее готовые библиотеки были смешаны, после этого специалисты проводили двойную гибридизацию с зондами панели SeqCap EZ Choice согласно протоколу производителя (размер панели 2 424 836 п.о.). Гибридизация была проведена при 47ºС в течение 16 часов. Гибридные комплексы обогащались с помощью SeqCap Capture beads. Также проводилась отмывка от неспецифичных фрагментов и амплификация  с помощью KAPA HiFi HS MasterMix (Roche, Швейцария) в течение 5 циклов. После этого специалисты повторяли процедуру гибридизации как описано выше. Финальная амплификация обогащенных библиотек составляла 16 циклов.
Секвенирование пула обогащенных библиотек проводилось на приборах NextSeq или NovaSeq (Illumina, США) с использованием парноконцевых прочтений. Среднее покрытие составило 578х, доля корректно картированных прочтений – 98,2%, доля целевых регионов с покрытием выше 200x – 95,3%.

Библиотека для секвенирования выбранных точек в цоДНК была подготовлена с помощью индивидуально подобранных праймеров с UMI, секвенирование проводилось на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием парноконцевых прочтений. Среднее покрытие составило 12400х.

Биоинформационная часть

Данные секвенирования анализируются в соответствии с рекомендациями GATK Best Practices (институт Броада) для поиска соматических мутаций, а также для мутаций в свободноциркулирующей ДНК. Обнаруженные с помощью Mutect2 соматические мутации оцениваются с помощью инструментов FilterMutectCalls, FilterAlignmentArtifacts и FilterByOrientationBias для фильтрации ложноположительных вариантов.

Каждый блок вычислений выполняется в изолированном окружении с выделением оптимального количества ресурсов и максимальной параллелизацией процессов. Постобработка вариантов проводится с помощью индивидуальных фильтров по качеству, что позволяет существенно улучшить показатели чувствительности и специфичности для обнаружения мутаций.

Вычислительный конвейер автоматически подстраивается под размер входных файлов и распределяет нагрузку по необходимому числу контейнеров, что дает возможность быстро и эффективно обрабатывать данные любого размера - от таргетных панелей до экзомов и геномов.